首個PROTAC分子的論文發布之后的20年里，這一技術從學術界轉化為臨床前和臨床期新藥開發項目，并且在2019年首次在腫瘤學領域獲得臨床概念驗證。在過去的2021年，PROTAC等蛋白降解技術是生物醫藥行業的熱詞之一。輝瑞、拜耳、百時美施貴寶、禮來等大型藥企也在這一領域紛紛布局。

近日，蛋白降解領域明星公司Arvinas的聯合創始人之一，耶魯大學的Craig M. Crews教授和合作伙伴聯合在Nature Reviews Drug Discovery上發表深度綜述，展望了PROTAC靶向蛋白降解技術未來20年的發展方向。作者們指出，靶向蛋白降解領域已經“整裝待發”，挑戰此前被認為“不可成藥”的靶點。

PROTAC技術發展的歷史和目前的臨床開發狀態藥明康德內容團隊已經在多篇文章中做過介紹。今天的這篇文章里，藥明康德內容團隊將著重與讀者分享這篇綜述中，作者列出的PROTAC靶向蛋白降解技術未來20年的四大發展方向。

確立最適合蛋白降解的靶點類型

第一波臨床期蛋白降解劑的靶點為已經獲得臨床驗證的成熟靶點，比如Arvinas公司選擇的雄激素和雌激素受體。針對這些靶點的成功確立了蛋白降解劑成為一種治療模式。然而，這一治療模式真正的潛力在于觸達目前治療模式難于成藥或不可成藥的靶點。那么哪些靶點是PROTAC療法的理想靶點。綜述總結了PROTAC靶點的幾大常見特征，它們包括：

蛋白的過度表達、突變、聚集、異構體表達或細胞內定位，以功能獲得性的方式導致疾病；

具有能夠被E3連接酶觸達的結合表面；

如果有能夠進入蛋白酶體的無結構區域則更為理想。

因為基因突變對常規靶向療法產生耐藥性的蛋白，具有骨架功能的蛋白和用其它治療模式“不可成藥”的蛋白也可能是適合使用PROTAC技術的靶點。

▲PROTAC靶點的特征（圖片來源：參考資料[1]）

雖然適合使用PROTAC蛋白降解的靶點不需要一個酶活性位點，它們需要一個能夠被E3連接酶觸達的小分子結合位點。這一位點的親和力不需要特別高，通常在1~500 nM的范圍內就可以，募集的E3連接酶必須能夠觸達靶點的表面。

對于骨架蛋白來說，選擇結合位點尤為關鍵，因為存在于復合體中的靶點蛋白只有部分表面暴露出來。對于那些大部分表面都隱藏在復合體中的靶點，靶向復合體中的鄰近蛋白不失為一種策略。

雖然與靶點蛋白結合的配體的親和力不需要很高，但是與E3連接酶結合的配體應該具有強結合力和緩慢的解離速度。能夠與E3連接酶共價結合的PROTAC分子能夠將三個部分（靶點，PROTAC分子和E3連接酶）組裝的動態變化簡化為兩個部分（靶點，PROTAC/E3連接酶復合體），這可能增強催化效率。

擴展可用的E3連接酶

目前，第一波處于臨床開發階段的靶向蛋白降解藥物大多傾向于募集名為CRBN的E3連接酶，一個值得關注的例外是Dialectic Therapeutics公司開發的BCL-XL降解劑DT2216，它募集了名為VHL的E3連接酶。不過，靶向蛋白降解的潛力讓學術界和醫藥界都在探索新的E3連接酶。人體中有超過600種E3連接酶，綜述指出，目前的問題是基于新E3連接酶的靶向蛋白降解療法何時造福患者，用于治療什么疾病，而不是它們會不會出現。

PROTAC分子的一個優勢在于可以根據靶點，通過選擇募集連接酶的分子和連接子（linker），理性設計蛋白降解劑。它的模塊式特征意味著針對不同的靶點，可以替換與E3連接酶結合的模塊，募集達到最佳治療效果的E3連接酶。

雖然基于募集CRBN和VHL連接酶的PROTAC分子設計已經日漸成熟，它們的臨床前和臨床期開發仍然面對多重挑戰。尤其在腫瘤學領域，對治療藥物的耐藥性可以迅速出現，腫瘤可能通過產生基因突變，逃避依賴非必需連接酶（比如CRBN和VHL）的蛋白降解劑的作用。臨床前研究已經發現有些腫瘤能夠通過在泛素連接酶系統的組成部分中引入突變或降低表達來逃避蛋白降解劑的作用。這些挑戰給發現新的E3連接酶帶來機會。那么，適合臨床開發的新E3連接酶應該具有什么樣的特征？我們應該從哪些方向尋找新的E3連接酶？綜述作者提出了以下幾個方向：

應用廣泛，普遍存在的連接酶

這些連接酶和CRBN或VHL一樣，能夠與任何靶點蛋白匹配，從而用于治療很多不同的疾病適應癥。目前所有的PROTAC分子都只使用了少數幾個這種類型的連接酶，它們的信息可以在線上數據庫PROTAC-DB中查詢。

有趣的是，針對同一靶點蛋白，募集VHL還是CRBN可能導致不同的降解效率。比如在針對KRAS G12C的蛋白降解劑開發方面，已有的研究發現KRAS G12C可以被PROTAC系統靶向，但是降解的效果會受到募集的E3連接酶是VHL還是CRBN的影響。

多個因素可能影響連接酶的降解特征，包括連接酶的構象和靶點蛋白之間的互補性；連接酶與靶點蛋白直接構成可導致降解的三元結構的能力；不同連接酶和靶點蛋白的細胞內定位；以及細胞類型特異性連接酶和靶點的表達。

綜述指出，基于連接酶的結構特征，可以判斷一些值得用于PROTAC蛋白降解的連接酶，而去年DeepMind和RoseTTAFold在基于氨基酸序列預測蛋白三維結構方面的突破，可能重新定義哪些連接酶可以用于開發蛋白降解療法。

組織和細胞特異性E3連接酶

連接酶的組織和細胞特異性，以及在腫瘤中的富集程度和是否對腫瘤必不可少，可能為針對特定領域的蛋白降解療法提供開發機會。學術界和醫藥行業都對發現具有獨特表達特征的E3連接酶具有濃厚的興趣，從而進行精準靶向蛋白降解（precision TPD），這是蛋白降解領域的“圣杯”之一。

以往的研究已經發現了一些在特定組織中表達的E3連接酶，比如名為RNF182和TRIM9的E3連接酶特異性表達在中樞神經系統（CNS）中，它們可能對于靶向神經元疾病具有重要意義。CNS特異性靶向降解可以避免全身性的脫靶和毒副作用。

有趣的是，有些連接酶在特定組織和細胞中表達水平特別低，這一特征對蛋白降解劑來說也可能提供機會。一個出色的例子是VHL在血小板中的表達水平低，因此募集VHL的PROTAC分子DT2216在降解BCL-XL的時候能夠避免傷害到血小板，從而降低了血小板導致的毒性，提高了它的治療指數。目前它處于1期臨床開發階段。

▲不同類型的E3泛素連接酶（圖片來源：參考資料[1]）

在疾病組織或細胞中富集的E3連接酶

精準靶向蛋白降解的另一個前沿是特異性靶向腫瘤細胞的PROTAC分子。達成這一目標的一個策略是靶向腫瘤特異性或在腫瘤富集的E3連接酶。一般來說，在腫瘤中富集的E3連接酶與腫瘤依賴的E3連接酶重合。這一相關性可用于發現對于多種癌癥細胞類型都必需的E3連接酶，它們的優勢在于腫瘤細胞難于通過連接酶的突變來產生對PROTAC分子的耐藥性。

不過，這類連接酶能否真正改善PROTAC分子的治療指數還需要實驗驗證。一個潛在問題是在腫瘤中高度富集或者腫瘤依賴的E3連接酶大多跟細胞周期相關。基于這些連接酶開發的PROTAC分子可能產生和經典化療藥物類似的毒性，不過這一可能性仍然需要實驗驗證。

最后，癌癥睪丸抗原（CTAs）也包括在正常組織中表達有限但是在多種癌癥類型中高度表達的泛素連接酶，一個例子是黑色素瘤抗原基因（MAGE）家族中的泛素E3連接酶。

發現、研究和開發腫瘤特異性E3連接酶用于蛋白降解只是獲得腫瘤特異性PROTAC分子的策略之一。另一種策略是利用抗體對腫瘤的特異性，將降解分子偶聯在腫瘤特異性抗體上。基因泰克（Genentech）和其合作伙伴的研究已經展現出抗體偶聯PROTAC分子的腫瘤靶向特異性。不過，抗體偶聯PROTAC會失去小分子PROTAC的口服特征。

治療腫瘤學以外的疾病

目前已經獲批的蛋白降解藥物（度胺類藥物）和大多數新開發的臨床期PROTAC分子和分子膠化合物用于治療不同類型的癌癥。然而，靶向蛋白降解的范圍正在向腫瘤學以外的領域擴展。

炎癥、免疫和免疫腫瘤學

在第一波進入臨床開發階段的降解劑中，Nurix公司的布魯頓氏酪氨酸激酶（BTK）抑制劑NX-5948和Kymera公司的IRAK4降解劑（KT-474）將檢驗PROTAC治療模式在非癌癥疾病方面的應用。它們可以用于治療多種免疫炎癥疾病，比如類風濕性關節炎。

在免疫檢查點抑制劑獲得成功之后，開發能夠激發抗癌免疫反應的小分子藥物是藥物開發的一個重要領域。PROTAC分子具有以小分子藥物的模式激活免疫細胞，模擬PD-1/PD-L1靶向療法效果，成為潛在“first-in-class”療法的潛力。最近，靶向MAP4K1的PROTAC分子已經表現出可喜的臨床前活性。

雖然在這個方面，小分子抑制劑可能達到同樣的目的，但是PROTAC分子可能具有更好耐受性和更低的毒副作用。

神經病學和神經退行性疾病

PROTAC分子的關鍵性特征之一是能夠降解因為沒有活性位點而不被傳統小分子抑制劑靶向的蛋白。這一特征讓在多種神經退行性疾病中積累的蛋白（比如Tau蛋白，α突觸核蛋白，亨廷頓蛋白突變體…）成為潛在靶點。

Tau蛋白病（Tauopathies）是一類小分子藥物難于靶向，但是PROTAC分子可以有所作為的疾病領域。它們包括阿爾茨海默病、額顳葉癡呆（FTD）等神經疾病。這些疾病的病理與異常Tau蛋白的聚集和累積相關，產生的神經原纖維纏結可導致神經元的死亡。

降低Tau蛋白的水平是正在被積極探索的一個研發方向，在臨床前模型中，使用反義寡核苷酸（ASO）療法已經成功降低Tau蛋白水平并逆轉Tau蛋白相關病理。開發靶向Tau蛋白的PROTAC分子或其它小分子降解劑可以把降低Tau蛋白水平的表型與全身性給藥和穿越血腦屏障的特征結合在一起，目前是一個尤為受到關注的領域。

Tau蛋白單體是一個天然無序蛋白，沒有明確的供小分子藥物結合的“口袋”。然而，小分子探針能夠與Tau蛋白的寡聚體結合，目前已經作為試劑用于PET掃描。一個策略是將這種PET跟蹤劑改裝成募集CRBN的PROTAC分子，它在細胞培養模型中已經表現出降解Tau蛋白的能力。

在帕金森病患者中積累的α突觸核蛋白與Tau蛋白類似，也是一種天然無序蛋白。此前的研究已經報告了一款基于多肽的α突觸核蛋白降解劑，它在實驗中保護神經元不受α突觸核蛋白過度表達引發的神經毒性的傷害。

抗病毒PROTACs

抗病毒PROTAC分子的可行性最初在降解丙肝病毒（HCV）NS3/4A蛋白酶的研究中得到確立。隨著新冠病毒的出現，這一策略也被用于靶向新冠病毒。新冠病毒的主要蛋白酶（Mpro和PLpro）和RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）目前被小分子抑制劑靶向。它們可能成為PROTAC分子的潛在靶點。

Nurix Therapeutics公司目前正在開發針對新冠病毒的三款蛋白降解劑。

開發創新PROTAC模式

創新PROTAC策略，包括基于生物制品的PROTACs（bioPROTACs）和雜合體PROTACs（hybrid PROTACs）可能進一步擴展PROTAC可以靶向的靶點范圍。這篇綜述中將PROTAC分子劃分為三類，傳統的小分子PROTACs，包含多肽或其它生物制品的PROTACs（bioPROTACs）和同時包含多肽和傳統小分子“彈頭”的PROTACs（雜合體PROTACs）。

生物制品PROTACs利用多肽、融合蛋白、以及寡核苷酸等作為識別靶點的配體。基于融合蛋白或者多肽的PROTACs已經在研究中成功降解HER2、MYC、KRAS等與癌癥相關的靶點。基于寡核苷酸的PROTAC可以用于靶向轉錄因子和RNA結合蛋白。這些蛋白如果出現突變，會導致多種類型的癌癥，以及肥胖癥、心血管和神經疾病。

這些生物制品PROTACs有潛力成為一種新的治療模式，不過它們的遞送和給藥模式是需要跨越的障礙。這些療法可能需要以基因療法的方式遞送，利用精準調控的啟動子來控制細胞內的表達水平。基于納米顆粒的遞送技術和基于病毒載體的基因遞送系統的發展將在這一治療模式的進展中起到重要作用。

短期來看，生物制品PROTACs可以作為工具分子，驅動小分子PROTACs的開發，它們可以用于確認降解蛋白帶來的完全抑制與小分子抑制劑導致的部分抑制相比，能否帶來更好的生物學效果；或者比較蛋白表達后降解與利用RNAi抑制蛋白表達之間的生物學區別；還可以用于確定靶點蛋白的哪個表面能夠被E3連接酶觸達。

PROTACs也激發了科學家們利用非蛋白酶體的降解系統，開發靶向蛋白降解劑的努力。目前已經有LYTAC，ATTEC等多種其它降解模式被開發出來，它們具有各自獨特的特征。

▲不同靶向蛋白降解策略作為治療模式的特征（圖片來源：參考資料[1]）

結語

作者表示，基于靶向蛋白降解在過去20年的進展和學術界與工業界對它的興趣和投入，很明顯這一技術可成為一種關鍵性治療模式。他們相信，這一治療模式具有為廣泛疾病患者提供創新治療選擇的潛力。

參考資料：

[1] Békés et al., (2022). PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue. Nature Reviews Drug Discovery, https://doi.org/10.1038/s41573-021-00371-6